Fondato nel 1288 da Folco Portinari, il padre della Beatrice di Dante (1265-1321), raggiunse sotto il governo mediceo uno sviluppo notevole. I Medici ne avevano affidata l'amministrazione ad un corpo di "Spedalinghi", scelti fra i membri della nobiltà. La finalità dell'Ospedale era comunque quella di un ricovero piuttosto indifferenziato.

Strettamente legata alla storia dell'Ospedale è quella dell'annessa Scuola di Chirurgia dove medici illustri svolsero attività didattica ospedaliera. Il loro lavoro scientifico nonché il patrimonio culturale dell'Ospedale sono testimoniati dalla ricca Biblioteca.

Al periodo rinascimentale risalgono le prime notizie relative all'attività di una Spezieria dove venivano preparati i medicamenti utilizzando le piante dell'Orto Botanico appositamente creato.

Nel 1688 fu costruito all'interno dell'Ospedale uno "spedaletto" da destinarsi a pazzeria, cioè ad accogliere unicamente i malati di mente.

Con Pietro Leopoldo (1747-1792) l'organizzazione dell'Ospedale migliorò notevolmente: venne realizzato uno stretto collegamento fra insegnamento medico e ospedale; furono regolati il numero, gli obblighi d'insegnamento e di cura, lo stipendio del personale, dei professori, dei lettori. Nel 1762 fu istituita anche una scuola di ostetricia. Dal 1880 vi furono allestiti laboratori di Chimica farmaceutica.