Si formò negli ambienti umanistici della Firenze quattrocentesca, per dedicarsi ad attività commerciali e finanziarie. Inviato a Siviglia da Lorenzo di Pierfrancesco de' Medici, vi si stabilì e iniziò a collaborare con i viaggiatori spagnoli e portoghesi che sulla scia di Cristoforo Colombo lasciavano l'Europa per esplorare il Nuovo Mondo. Le scarse notizie documentarie e la dubbia autenticità delle sue lettere più famose circolanti fin dai suoi tempi, sulle quali non c'è tuttora accordo fra gli storici, non ci danno la possibilità di stabilire neppure il numero effettivo dei viaggi transoceanici ai quali Vespucci partecipò. Certo è però che percorse gran parte delle coste sudamericane, dal Venezuela al Brasile, e fu il primo a intuire di trovarsi su un nuovo continente e non in una parte ancora sconosciuta dell'Asia, dove non sarebbe stata possibile l'esistenza di quei popoli, di quella flora, di quella fauna. Cartografo, esperto conoscitore delle posizioni delle stelle, come dell'uso di quadranti e astrolabi (riuscì a stabilire la longitudine in mare sulla base della distanza lunare) fu nominato Piloto Mayor de Castilla dal re di Spagna Ferdinando II d'Aragona, col compito di sovrintendere alla preparazione delle campagne esplorative nel nuovo continente e all'addestramento del personale di bordo nell'uso degli strumenti.