Studiò matematica a Padova. Dal 1572 al 1575 seguì l'insegnamento privato di Commandino (1509-1575) a Urbino. Nel 1577 pubblicò la Mecanica e nel 1588 il commentario all'opera di Archimede (287-212 a.C.) sui centri di gravità, un testo sul quale stava lavorando in quello stesso tempo Galileo (1564-1642) che gli inviò i propri teoremi. Nel 1588 Guidobaldo fu nominato ispettore delle fortificazioni del Granducato di Toscana, ma continuò a risiedere soprattutto a Monte Baroccio, nei pressi di Urbino, proseguendo gli studi e gli esperimenti e pubblicando altre opere di matematica e di meccanica. Restò in corrispondenza con Galileo in modo discontinuo fino alla morte.