Figlio di Cosimo I (1519-1574), fu creato cardinale in gioventù, ma abbandonò l'abito religioso per divenire Granduca nel 1587, quando suo fratello Francesco I (1541-1587) morì senza lasciare eredi maschi. Fu il promotore del potenziamento del porto di Livorno e sviluppò le collezioni medicee d'arte, di natura e di strumentazione tecnico-scientifica. Imitando l'atteggiamento dei grandi sovrani del suo tempo, finanziò viaggi di ricerca, come quello botanico del fiammingo Giuseppe Casabona (c. 1535-1595) a Creta, la cui eco è costante nei grandi testi di botanica dell'ultimo '500 e del primo '600. Mantenne strettissime relazioni con Ulisse Aldrovandi (1522-1605), né lesinò appoggi al programma di sistematica raccolta di miniature (fiori, piante, animali) promossa da Francesco I. Il Granduca riprese, infine, molte delle attenzioni e degli interessi riservati da Cosimo I alle discipline matematiche, rimaste estranee al gusto di Francesco I, proponendosi di pubblicare una serie di testi di matematici greci fino ad allora inediti (molti codici, preparati per la stampa, si conservano tra i manoscritti magliabechiani della Biblioteca Nazionale Centrale di Firenze). Curò con particolare attenzione l'educazione del figlio, il futuro Cosimo II (1590-1621), tra i cui precettori fu anche Galileo (1564-1642).