Subentrò al padre Cosimo II (1590-1621) come Granduca di Toscana nel 1621, sotto la reggenza della nonna Cristina di Lorena (1565-1636) e della madre Maria Maddalena d'Austria. Favorì i traffici marittimi, dando impulso al porto di Livorno e stipulando trattati commerciali. Sostenne Galileo (1564-1642) e ne incoraggiò le ricerche. Durante il processo del 1633, si adoperò energicamente perché lo scienziato pisano fosse riconosciuto innocente e lasciato libero di proseguire i propri studi. Dopo la condanna di Galileo perseguì cautamente l'obiettivo di una sua revoca o attenuazione. A partire dalla metà degli anni quaranta del Seicento, il Granduca avviò a Corte un'attività informale di sperimentazione. Furono realizzate esperienze con i primi termometri mai costruiti, fu misurata l'umidità dell'aria con l'igrometro a condensazione, "la gravezza o la leggerezza d'una cosa liquida" con l'areometro. Nel 1644, nella serra degli agrumi del Giardino di Boboli, fu sperimentata una sorta di incubatrice artificiale per far nascere i pulcini, basata sulla temperatura rilevata con un termometro sessantigrado posto sotto una gallina che covava. Queste attività sperimentali costituiscono la premessa dalla quale prese avvio l'Accademia del Cimento, fondata nel 1657 dal fratello Leopoldo (1617-1675).