Fondato dal Granduca di Toscana Pietro Leopoldo (1747-1792) e aperto al pubblico nel 1775, ebbe sede in alcuni edifici di via Romana, a Firenze, assai vicini a Palazzo Pitti. Suo primo direttore fu Felice Fontana (1730-1805). Nel nuovo Museo furono progressivamente trasferiti tutti gli oggetti di interesse scientifico provenienti dalle collezioni medicee, ai quali si aggiunsero le nuove macchine e collezioni costruite e acquistate per iniziativa del Granduca lorenese. Successivamente al trasferimento a Vienna di Pietro Leopoldo (1790), divenuto Imperatore, il Museo entrò in una fase di progressiva decadenza. Nel 1841 vi fu inaugurata la Tribuna di Galileo, nella quale furono collocati gli strumenti più antichi e, in particolare, quelli costruiti e usati da Galileo (1564-1642). A seguito dell'Unità d'Italia, le collezioni del Museo furono smembrate per dotare di libri e collezioni le Facoltà del nuovo Regio Istituto di Studi Superiori.